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单克隆抗体

 

 

一、抗体的结构与功能


1、抗原:进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。
包括:蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。
特点:外源性、结构性(分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点)、特异性(抗原与抗体的反应)。
2抗体
动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白,存在于血清中,本质是免疫球蛋白(Immuniglobulin,Ig)。
动物脾脏有上百万个B淋巴 细胞,一个细胞就是一个克隆,它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。
一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族,因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体,因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物,称为多克隆抗体。


二、单克隆抗体的制备


•        动物免疫与亲本细胞的选择
•        细胞融合:淋巴细胞杂交瘤的制备
•        杂交瘤细胞的筛选:有限稀释法等
•        单克隆抗体的制备和冻存
•        单克隆抗体的纯化


亲本细胞的选择


•        骨髓瘤细胞:一般不分泌抗体,能在体外无限繁殖和连续继代培养,且为HPRT-(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或TK-(胸腺嘧啶核苷激酶) 。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。[小鼠骨髓瘤细胞能在体外无限增殖传代并不分泌抗体。肿瘤细胞DNA生物合成有两条途径:一条由糖、氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,这是主要途径。这条途径可被叶酸的拮抗物—氨基喋呤(A)所阻断(但如果培养基中含核苷酸“前体“次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷,即便有A存在,细胞通过另一途径(称替代途径或应急途径)也可合成核苷酸。但后一途径需次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶 (TK)存在)。]
•        淋巴细胞:经过免疫处理的淋巴细胞,多用大鼠或小鼠。
•        免疫方法:对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内,可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后,注入到动物体内。 
细胞融合
•        将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2:1或10:1的比例混匀于50ml锥形离心管内,1200rpm离心7¡ª10分钟,尽量吸净上清液,用手指轻击管壁,使管底沉淀的细胞铺展成薄层,在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml,随后静置90秒,再于5分钟内边振摇边逐滴加入5-10ml不含血清的培液或盐水缓冲液,以终止PEG的作用,再静置10分钟。
HAT培养基筛选杂交瘤细胞
•        细胞团块分散后,加HAT溶液,即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml,
•        用HAT选择性培养时隔4-5天换液,8-10天后可以选择检测。
HAT选择系统
•        HAT是含一定浓度次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)的一种选择性培养基,其中三种成分与细胞DNA合成有关。
•        DNA合成途径有两种。1.主要途径2.次要途径:
•        杂交瘤技术中,常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(HPRT-)骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)骨髓瘤细胞为亲本之一。
•        HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生;
•        TK- 细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。
•        含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。
•        淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。
•        杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因,可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷,通过补救合成途径合成DNA。
•        在HAT培养基中,HPRT- 或TK-  亲本细胞死亡,淋巴细胞亦逐渐死亡,只有杂种细胞存活。
特异性杂交瘤细胞的筛选
•        通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞,仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液,根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。

杂交瘤细胞的克隆化培养
•        利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。
•        在培养过程中,一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞,如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞
•        或胸腺细胞等。
•        方法有有限稀释法、软琼脂培
养法、显微操作法、应用荧光
激活分选仪等。
有限稀释法
•        通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的
•        1)取出阳性孔内的细胞进行计数
•        2)用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。
•        3)如果在96孔板内每孔加0.1ml,
•        其机率将为每孔内落入一个细胞。
•        4)加入一定数量的饲养细胞,
•        经过2~3天后,可观察到有集落生长的孔,并标记单克隆。
•        10天左右可以检测。
•        5)根据检测的阳性结果再次进行克隆化。
•        诱生腹水
•        将稳定分泌单抗的细胞株,通过扩大培养,接种于Balb/c小鼠腹腔内,使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖,从而得到大量含单抗的腹水。
•        方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔,0.5ml/只,7天后腹腔接种3~5×106  杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水,每毫升腹水中约含1~10mg单抗。

 

一般的筛选方法:
ELISA:酶联免疫吸附实验,通常用间接法。
WB:免疫蛋白印迹。
ICC:免疫细胞化学。
IHC:免疫组织化学


4、人源单克隆抗体
•        方法1:分离人B细胞,使之与荧光标记的抗原相结合,通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B细胞,并用Epstein-Barr病毒转化,得到少量的单抗。
•        方法2:将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内,遇到抗原时,产生人源的抗体。
•        方法3:将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中,能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠
5、抗体融合蛋白
•        将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来,使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留不同程度的抗体结合特异性和激发其他免疫反应的能力。
6、抗体酶
•        一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点,既可以起酶促催化作用,又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。
•        制备抗体酶的方法:
•        1)利用与过渡态结构相类似的半抗原通过杂交瘤技术生产抗体酶。
•        2对抗体进行化学修饰,使抗体与催化基团相连。

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